Формати генетичних даних: що таке FASTQ, VCF, PLINK та інші

Прозора 3D-спіраль ДНК, усередині якої записані числові та літерні послідовності із підсвіченими маркерами, — головне зображення до статті про формати генетичних даних.

Коли ваш зразок слини потрапляє в лабораторію, він проходить кілька етапів обробки, перш ніж перетворитися на звіт із результатами. На кожному етапі дані зберігаютьсяу своєму форматі: спочатку у вигляді сирих послідовностей, потім як карта вирівнювання, потім як таблиця виявлених варіантів, і нарешті як структурований набір для статистичного аналізу. Наприклад, один показник вашого звіту про схильність до підвищеного холестерину спирається на дані, які на різних етапах існували у форматах FASTQ, BAM, VCF і PLINK, перш ніж перетворитися на єдиний бал. Найпоширеніша помилка — вважати, що «генетичні дані» це один файл. Насправді це конвеєр форматів, кожен з яких відповідає за свій етап аналізу.

Щоб розуміти, що відбувається між зразком слини і вашим звітом, достатньо розібратися з чотирма ключовими форматами: FASTQ, BAM, VCF і PLINK. Саме вони утворюють стандартний аналітичний ланцюжок у сучасній геноміці. Розберемо кожен по черзі.

FASTQ: сирі дані прямо з секвенатора

FASTQ (вимовляється «фаст-к'ю») — це формат, у якому зберігаються сирі результати секвенування. Назва походить від скорочення FASTA (формат зберігання послідовностей ДНК) з додаванням літери Q від англ. Quality, «якість». Уявіть, що секвенатор читає вашу ДНК як текст, але не впевнений у кожній букві: FASTQ зберігає і саму послідовність, і оцінку впевненості для кожного нуклеотиду окремо.

Кожен запис у FASTQ-файлі складається з чотирьох рядків: ідентифікатора фрагмента, самої нуклеотидної послідовності, роздільника і рядка показників якості. Наприклад:

@read_001

ACGTTAGCATGC...

IIIIHHGFEDCB...

Рядок якості кодує впевненість секвенатора у кожній «букві»: чим вищий символ за шкалою ASCII (від англ. American Standard Code for Information Interchange, «американський стандартний код обміну інформацією»), тим надійніше прочитано цей нуклеотид. Файли FASTQ великі, зазвичай кілька гігабайт на один зразок, і є вхідною точкою для всього подальшого аналізу. Самі по собі вони не придатні для інтерпретації: це ще не «генетичні дані» у розумінні конкретних варіантів, а лише сировина.

Сяюча помаранчева сфера в центрі, до якої з усіх боків через прозорі кристали сходяться світлові волокна даних, — ілюстрація обробки популяційних даних та розрахунку PRS.

BAM: послідовності, вирівняні по геному

Наступний крок після FASTQ — вирівнювання. Програма порівнює кожен короткий фрагмент із еталонним геномом людини і визначає, до якої ділянки він належить. Результат зберігається у форматі SAM (від англ. Sequence Alignment Map, «карта вирівнювання послідовностей») або у його стисненій бінарній версії — BAM (від англ. Binary Alignment Map, «двійкова карта вирівнювання»). На практиці завжди використовують BAM: він займає значно менше місця при тих самих даних.

BAM-файл можна уявити як величезну таблицю: кожен рядок описує один прочитаний фрагмент ДНК, його позицію в геномі, орієнтацію, якість вирівнювання і додаткову технічну інформацію. Разом усі рядки формують покриття геному: скільки разів кожна позиція була прочитана. Чим вище покриття, тим надійніше виявлення варіантів на наступному кроці.

BAM-файли ще більші за FASTQ і потребують спеціального індексного файлу — BAI (від англ. BAM Index, «індекс BAM»), щоб швидко знаходити потрібні ділянки без читання всього файлу цілком. Для більшості людей, що отримують генетичний звіт, BAM залишається «за кулісами»: лабораторія обробляє його автоматично і не передає кінцевому користувачу.

VCF: таблиця виявлених варіантів

Після вирівнювання алгоритм порівнює покриті позиції з еталонним геномом і фіксує місця, де ваша ДНК відрізняється. Ці відмінності записуються у форматі VCF (від англ. Variant Call Format, «формат запису варіантів»). Саме VCF є першим форматом, де з'являються конкретні генетичні варіанти: SNP (однонуклеотидні поліморфізми), невеликі вставки та делеції.

Кожен рядок VCF-файлу описує один варіант: хромосому і позицію, еталонний нуклеотид, альтернативний нуклеотид у вашому геномі, якість виклику і генотип. Наприклад, рядок може показувати, що на хромосомі 11 у позиції 5246696 у вас стоїть G замість еталонного A — тобто ви є носієм певного варіанта в гені HBB. Саме з VCF-файлів беруться rs-номери, які ви бачите в таблиці маркерів свого звіту.

VCF є стандартним форматом обміну між лабораторіями, дослідниками і програмами аналізу. Якщо ви хочете завантажити власні генетичні дані у відкриту базу, наприклад ClinVar або dbSNP, саме VCF є найпоширенішим вхідним форматом для таких операцій.

Світловий потік цифрового коду та даних, що проходить крізь рельєфний геометричний каньйон зі світлих блоків, — ілюстрація конвеєра конвертації форматів генетичних даних.

PLINK: формат для популяційного і полігенного аналізу

VCF зручний для зберігання варіантів одного індивіда, але незручний для одночасного аналізу тисяч людей. Для популяційної генетики і розрахунку полігенних профілів ризику (PRS, від англ. Polygenic Risk Score, «полігенний показник ризику») використовується формат PLINK, розроблений однойменною програмою для статистичного аналізу даних GWAS (від англ. Genome-Wide Association Study, «полногеномне асоціативне дослідження»).

PLINK зберігає дані у трьох пов'язаних файлах. Файл .bed містить генотипи у стисненому двійковому форматі. Файл .bim описує кожен SNP: хромосому, позицію, rs-номер і обидва алелі. Файл .fam містить інформацію про індивідів: їхні ідентифікатори, стать і, якщо є, фенотипові дані. Разом три файли утворюють один набір, з яким працюють алгоритми розрахунку PRS.

Уявіть PLINK як велику електронну таблицю: рядки це люди, стовпці це позиції SNP, а значення в комірках це генотипи. Саме в такому вигляді великі популяційні когорти, наприклад UK Biobank із майже 500 тисячами учасників, передають дані для GWAS-досліджень, результати яких потім лягають в основу полігенних профілів у вашому звіті.

Інші формати: FASTA, BED і GFF

Окрім чотирьох основних форматів конвеєра, у геноміці регулярно зустрічаються ще кілька:

FASTA (від англ. Fast Alignment, хоча назва склалася історично) — базовий формат для зберігання самих послідовностей ДНК або білків без інформації про якість. Саме у FASTA зберігається еталонний геном людини GRCh38 (від англ. Genome Reference Consortium Human Build 38, «збірка 38 еталонного геному людини»), з яким вирівнюються ваші дані.
BED (від англ. Browser Extensible Data, «розширювані дані для браузера») — формат для опису геномних координат: де саме на хромосомі починається і закінчується певна ділянка. Використовується для визначення регіонів інтересу, наприклад екзомів у WES (від англ. Whole Exome Sequencing, «секвенування всього екзому»).
GFF / GTF (від англ. General Feature Format / Gene Transfer Format, «загальний формат ознак / формат передачі генів») — формати для анотації геному: де знаходяться гени, екзони, регуляторні елементи. Коли у вашому звіті вказано, що SNP знаходиться у гені BRCA1 або поблизу нього, ця інформація отримана саме з GFF-анотації.

Як ці формати пов’язані з вашим звітом Apixmed Prism

Жоден із описаних форматів не потрапляє до вас безпосередньо, і це правильно. Аналітичний конвеєр від зразка слини до звіту виглядає так:

Конкретний набір форматів залежить від методу аналізу. При повногеномному секвенуванні (WGS, від англ. Whole Genome Sequencing) конвеєр проходить через усі чотири формати: FASTQ → BAM → VCF → PLINK. При генотипуванні на мікрочипі FASTQ і BAM відсутні: мікрочип одразу видає таблицю інтенсивностей, яка конвертується безпосередньо у VCF, і далі аналіз іде тим самим шляхом. Саме тому генотипування швидше і дешевше, але не виявляє варіантів поза межами чипа.

Секвенування або генотипування — на виході FASTQ і VCF або лише VCF відповідно
Вирівнювання по еталонному геному — результат у форматі BAM
Виявлення варіантів — таблиця SNP у форматі VCF
Розрахунок полігенних профілів — конвертація у PLINK і застосування вагових коефіцієнтів із GWAS-досліджень
Інтерпретація і звіт — числовий бал і позиція на шкалі, які ви бачите на сторінці кожного показника

Rs-номери, які ви бачите в таблиці маркерів свого звіту, це ідентифікатори конкретних рядків із VCF-файлу вашого аналізу. Якщо ви завантажуєте власні сирі дані, щоб дослідити їх самостійно або передати іншому сервісу, найзручніший для цього формат — саме VCF, оскільки він стандартизований і сумісний із більшістю аналітичних платформ.

Про те, що означають числові результати у вашому звіті, як читати шкалу і де проходить межа між схильністю та діагнозом, читайте у статті Як читати звіт Apixmed Prism: що означають результати.

Формат визначає, що можна з даними зробити

FASTQ фіксує сировину: послідовності і їхню якість. BAM показує, де ці послідовності знаходяться в геномі. VCF описує конкретні відмінності від еталону. PLINK дозволяє аналізувати ці відмінності одночасно у великих групах людей і розраховувати полігенні профілі. Кожен формат це один крок від зразка слини до результату у вашому звіті.

Розуміння цього конвеєра змінює спосіб сприйняття звіту: результат це не «думка» алгоритму, а кінцева точка стандартизованого аналітичного процесу, де кожен крок задокументований і відтворюваний. Rs-номери у таблиці маркерів, еталонний геном, ваговий коефіцієнт SNP — все це конкретні артефакти з конкретних файлів.

Якщо ви ще не зробили тест або хочете розширити свою генетичну картину, перегляньте напрями генетичного тестування Apixmed Prism.

Результати генетичного тесту це не діагноз і не заміна консультації лікаря. Звіт Apixmed Prism дає генетичний контекст, який доповнює результати обстежень і допомагає приймати рішення разом із лікарем.

Використані джерела

1. Cock, P. J. A., Fields, C. J., Goto, N., et al. (2010). The Sanger FASTQ file format for sequences with quality scores, and the Solexa/Illumina FASTQ variants. Nucleic Acids Research, 38(6), 1767–1771. https://doi.org/10.1093/nar/gkp1137

2. Danecek, P., Auton, A., Abecasis, G., et al. (2011). The variant call format and VCFtools. Bioinformatics, 27(15), 2156–2158. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr330

3. Purcell, S., Neale, B., Todd-Brown, K., et al. (2007). PLINK: A tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. American Journal of Human Genetics, 81(3), 559–575. https://doi.org/10.1086/519795

4. Li, H., Handsaker, B., Wysoker, A., et al. (2009). The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics, 25(16), 2078–2079. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp352